mansion88明升(中国)

实验原理:

CTAB (hexadecytrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基澳化铵)， 是一种阳离子 去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物，该复合物在高盐溶液中(>0.7 mol/L NaCI)是可溶的，并可稳定存在。顺利获得有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。

实验目的:

快速提取植物基因组DNA,可用于PCR检测，对转基因植株进行初步分子鉴定。

试剂:

CTAB: Bio Basic INC. (GB0308 BJ0011J)
Tris (进口分装)
浓盐酸(中平能化集团开封东大化工有限公司试剂厂)
NaCI (国药集团有限公司，分析纯)

1.5 xCTAB配方:

CTAB	15g
1M Tris:HCI (pH 8.0)	75 ml
0.5M EDTA(pH 8.0)	30 ml
NaCI	61.4g
Add ddH2O to	1000 ml
氯仿(国药，分析纯)
异戊醇(国药，分析纯)
95%乙醇(国药，分析纯)
离心机(Sigma, Beckman)

操作步骤:

1.取约2 cm长的水稻叶片置于1.5ml (或2 ml)离心管中:

2.在研钵中加入800 ul 1.5x CTAB，研磨叶片至匀浆并倒回离心管内:

3.65℃水浴20-30 min,每5 min中颠倒混匀次;

4.加入等体积的24:1 (氯仿/异戊醇)，上下颠倒混匀， 持续10 min;

5.10, 000 rpm离心， 10 min;

6.吸取400上清液至新的离心管， 加入2倍体积经冰镇的 95%乙醇，-20℃冰镇20 min;

7.12, 000rpm离心，15 min;

8.弃上清，加入500ul 75%乙醇，12,000rpm离心5min;

9.弃上清，置于超净台吹干或自然晾干，加100 ul ddH₂O溶解。

注意事项:

1.水浴颠倒混匀时，注意确认离心管盖是否盖好，避免颠倒时样品泄漏;

2.水浴后开离心管盖子时一定要一个一个完全打开， 保证样品之间不会出现交叉污染的机会;

3.用滴管加24:1时，由于氯仿具有很强的去除蛋白能力和腐蚀性，可以适当的少加一些(比样品的体积少)，一方面减少氯仿使用量(既节省试剂又环保)，另外避免下一步离心过程中导致离心管破裂(尤其是1.5ml离心管);

4.吸取上清是注意不要吸到固体残渣或氯仿;

5.如果只需要做阳性检测，可以只吸取300 μl上清液，抽提的DNA足够后续使用，同时可减少乙醇用量。

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